FAQよくある質問

 

プログラムフリーザー

IQ/OQやバリデーション、GMPに対応しますか?

はい、GMP施設向けにセンサーを校正証明書付きでご用意するとともに、設置現場でのIQ/OQ対応も承っております。詳細についてはお問い合わせください。

スターリング方式に関して、冷却機構が分かるような図面や資料はありますか?

申し訳ございませんが、開示可能な資料はご用意しておりません。

もし壊れてヘリウムが開放された場合、どの程度の量(体積)となりますか?

重量で2~3gです。完全に密閉構造ですので、機構的に開放することは想定しておりません。

ガスカートリッジの中身もすべて放出されたらどのくらいの量(体積)になりますか?

ガスカートリッジはありません。総量として2~3gです。

停電等で運転中に停止した場合、電源が復旧すると再度自動で復旧しますか?

接続しているノートパソコンの電源が維持されていれば、自動的に復旧します。

短時間停電の場合:ノートパソコンが内臓バッテリーで起動状態の場合は、プログラムフリーズを続行します。

長時間停電の場合:ノートパソコンの内蔵バッテリーが空になっていた場合、フリーザーは動作しません。

ノートパソコンとフリーザーの通信ケーブルが外れた場合:フリーザーは外れた時の温度を維持します。

動物用を購入後、ヒト用にプログラム入替えすることは可能でしょうか?

プログラムの交換に、本体のバージョンアップ等が必要ですので、初めからヒト用を購入されることをお勧め致します。

バイアルやチューブを一度に100~200本使用できますか?

チューブの種類と液量により処理可能な本数は変わりますので、詳細はお問い合わせください。

一般的な2mLクライオチューブの場合、FZ-2000は55本、FZ-3000は169本を処理できます。より細いチューブの場合はより多くの本数を処理できますが、形状や処理容量にも依存しますので、詳細はお問い合わせください。

凍結処理中に、制御用PCで他の作業をすることはできますか?

プログラム起動・処理中は他の作業は行わないでください。

凍結させる温度設定(凍結レート)はどれくらいですか?

-0.5~-3℃/minで設定可能です。

血液・細胞バッグの大きさはどれくらいまで対応可能ですか?

幅広く対応しておりますが、大きくなると機器のサイズも変わる為、別途お見積りとなります。

液体窒素に浸漬して凍結していますが、プログラムフリーザーとはどのような違いがありますか?

弊社のプログラムフリーザーは液体窒素を必要としておりませんので、マイコプラズマや相互汚染の心配がありません。また、細胞の生存率を向上させるための緩慢凍結法を用いた凍結速度を自由にプログラミングできます。

細胞進展システム

手動伸展装置を入れるディッシュを購入したのですが、サイズがあいませんでした。

ご参考までに、TPP社カタログ #93100 100mmディッシュは入ります。(http://www.bmbio.com/product_detail.php?itemid=848 )

STB-150には連続伸展時間に20分という制限がありますが、伸展のインターバルを長く取っても60分程度の連続観察は不可能でしょうか?

1時間の連続観察でしたら、10回/分まででしたら可能です。その場合、①保温装置 ②恒温還流装置が必要となります。

STB-140を使用しています。10cm^2の専用チャンバーを用いて細胞に伸展刺激(15%の伸展率)を加えて実験をしております。非常に初歩的な質問で恐縮ですが、この場合ひっぱる力というのは力学的な単位(例えばNなど)でいうとだいたいどれぐらいのものなのでしょうか?

弊社装置では計測できません。計測が必要な場合は別途装置の製作が必要となります。伸展時の細胞への負荷力を計測するシステムは論文等では発表されておりますので、参考といたしまして下記記載いたします。

Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load.
Gentaro Iribe,1 Michiel Helmes,1,2 and Peter Kohl1

1. Oxford University, Oxford, United Kingdom; and 2.IonOptix Europe, Wageningen, The Netherlands

Am J Physiol Heart Circ Physiol 292: H1487–H1497, 2007.
First published November 10, 2006; doi:10.1152/ajpheart.00909.2006.

ポリタンク内の冷却水に入れる防腐剤について教えていただけますか?

基本的に研究室でご使用されている防腐剤を添加いただくか、インキュベーターウオータージャケット用の防腐剤をご使用いただいており、特に推奨するメーカー等はございません。もしくは、実験中は防腐剤を入れず、次の実験に代わる際に水の入れ替えを行っていただくことでも可能です。

伸展装置を使用しているのですが、循環用の冷却水のシリコンチューブ内を中性洗剤もしくはアルカリ系で洗浄したいのですが問題ないでしょうか。

問題ございません。シリコンチューブの交換も承っております。

滅菌に関して、ポリタンクに一時的にエタノールを入れて還流させても大丈夫でしょうか。 また、次亜塩素酸を使用しても大丈夫でしょうか。

エタノールでの還流は問題ございません。次亜塩素酸は濃度が高いとポンプの弁を痛める可能性があるので、濃度に注意してご使用ください。50~100ppm程度を推奨します。

オートクレーブをかけることでチャンバーへの細胞の接着に影響するようなことはありますか?

オートクレーブは問題ありませんが、アルミホイルは使用しないでください。滅菌専用バッグを使用するようにしてください。

オートクレーブをかけることでチャンバーへの細胞の接着に影響するようなことはありますか?

オートクレーブは問題ありませんが、アルミホイルは使用しないでください。滅菌専用バッグを使用するようにしてください。

ストレッチチャンバーを洗浄しても膜面に白っぽい汚れが残ってしまいます。

ストレッチチャンバーは基本的にディスポーザブルでのご使用を推奨しております。洗浄可能ですが、完全に汚れを落とすことはできません。実験結果にも影響が出る可能性もありますのでご注意ください。

ストレッチチャンバーの材質・特性などを教えてください。

ストレッチチャンバーの材質はPOLYDIMETHYLSILOXANEを主体としたシリコンエラストマーです。表面は疎水性が強く、低細胞接着性です。細胞培養のためには培養面の細胞接着性を高めるために細胞外基質(ファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチンなど)でコーティングをして細胞培養を行います。(コーティング方法を参照ください)

ストレッチチャンバー底面の細胞全体に均一の負荷をかけることができるのでしょうか。

独自の伸展方式、モーターとプログラムの特性、ならびにストレッチチャンバーの材質、形状などの特性により可能となっています。これに対し、チャンバーを吸引することにより伸展させる方式では、チャンバー内の全細胞について伸展刺激の方向ならびに強度を均一にすることはできません。

持続的なストレッチと周期的なストレッチは細胞への影響は異なりますか?

持続的に細胞を伸展させた場合と周期的な伸展刺激を負荷した場合、細胞内で異なるシグナル伝達系を刺激することが報告されています。

(Ref)Sasamoto et al,2005,288,C1012-22

フィブロネクチンのコーティング有・無でDish上での細胞の接着状態を見てみようと思います。チャンバーは開封した後、何か洗浄が必要ですか?
また、チャンバー上についている、よごれ、ゴミの除去について、何か方法はありますでしょうか。

樹脂製シャーレは、浮遊細胞用または細菌培養用ディッシュを使用してください。
接着細胞用ディッシュでは、たとえファイブロネクチンがうまくコートされなくても非特異的に接着してしまいます。チャンバーは滅菌されておりませんので、オートクレーブしてご利用ください。特に洗浄は必要ありません。

10^8細胞をストレッチチャンバーで行い、回収できますか?
また、既存の10ccより大容量のチャンバーの作製は可能ですか?

大量培養用のストレッチも製造しておりますが、受注生産品となります。ちなみに、従来品でもフックを交換すれば、倍のチャンバーをセットすることができます。
この場合ですと、二段重ねで6×2=12個のチャンバーに同時に伸展刺激を与えることができます。一度に搭載できるチャンバー数を指定して頂ければ最適な方法をお見積します。

新しいチャンバーをフックにはめるのが難しく困っています。何か対策はありますか?

ミネラルオイル・フォンブリンオイル・テフロンオイル等をフックに塗っていただきますと抜き差ししやすくなります。

コーティング後のチャンバーの保存方法(保管方法、コーティングの効果期間)について教えてください。

基本的に用事調整を行っておりますのでコーティング後に保管した実績はございません。

使用されているPDMSからの溶出はないのでしょうか。

低分子量のPDMS・重合開始剤も出てくる可能性は否定できませんが、これが原因で実験に支障がでたという報告は今のところございません。

チャンバーをストレッチした際に、細胞の上に乗せた培地が均一した厚み 1.5mmになりません。細胞が培地が均一でないために、一部が表面近くにでてきてしまったりすることはありますでしょうか?

チャンバーの膜面が薄いとその重みで中央付近が余計にたるんで伸びる現象かと思いますが、実験には大きく影響は及ぼさないと思われます。気にされるのであれば解決策としてもう少し膜厚のあるチャンバーを検討することになります。ただし、膜が薄い方が観察しやすいです。
手動伸展装置を用いたご実験であれば、伸長状態でプラスチックの板など入れて支える、戻す時に外してまた板を入れる。などの方法もあります。

自動伸展装置STB-140を用いて伸展培養を行っています。
3日間の伸展培養を行い、培養液を採取して液中のgrowth factor等を調べようと思っています。しかし培養液が乾燥してしまい上手く培養が行えません。
シリコンチャンバーは「STB-CH-10」、培養液は3mlで培養しており、インキュベーターの加湿水は十分にあります。
シリコンチャンバーが破損している形跡もありません。

装置の蓋はかぶせてご実験いただいてますでしょうか。他の対応策を下記記載させていただきますので一度お試しいただけますでしょうか。

 チャンバーフックを移動させる際に、使用する角シャーレの蓋を実験中もチャンバーの上にセットしていただけますでしょうか。合わせて、伸展装置内の空いている場所に水の入った35mm/60mmシャーレを置いてください。培養液の蒸発が改善されると思います。

三次元培養を検討しています。使用するゲルについて何か推奨されているものはありますか?またフィブリンゲルは使用できますか?

現状、サイクルストレッチでの使用はコラーゲンゲルが良いかと思われます。フィブリンゲルにつきましては、使用実績がございません。
また当社ではKOKENのDME-02 コラーゲン中性溶液DMEM 2mg/mL Atelocollagen,DMEM は使用実績があります。

三次元培養を検討しています。使用するゲルについて何か推奨されているものは周期的伸展刺激を負荷した後、細胞のタンパクや、mRNAを採取したいと考えています。 シリコン膜からどのようにとったらよいですか?

現状、サイクルストレッチでの使用はコラーゲンゲルが良いかと思われます。フィブリンゲルにつきましては、使用実績がございません。
また当社ではKOKENのDME-02 コラーゲン中性溶液DMEM 2mg/mL Atelocollagen,DMEM は使用実績があります。

周期的伸展刺激を負荷した後、細胞のタンパクや、mRNAを採取したいと考えています。 シリコン膜からどのようにとったらよいですか?

ウエスタンブロッティング:PBSで洗浄後、電気泳動用sample bufferを直接ストレッチチャンバーに加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。

Immunoprecipitation(免疫沈降): PBSで洗浄後、細胞可溶化液を直接ストレッチチャンバーに加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。

mRNA:RNA用PBSで洗浄後、可溶化液を直接ストレッチチャンバーに加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。

線維芽細胞での試験を行う場合、 張力負荷が実際にかかっているかを調べる際に、なんらかの遺伝子発現量を指標にすることはできますでしょうか?

ウェスタンブロットでERKのリン酸化を行っていただければと思います。

機械受容チャネルについて言及されていますが、伸展刺激によってこの遺伝子のmRNA量が大きく変化するといった報告はありますでしょうか?

機械受容チャネルの遺伝子に関していくつかは同定してきているようですが、多くはまだ不明です。ですのでこちらに関しては文献等がございません。

ストレスをかけることによって細胞内のβアクチンの量に変化があるという報告 はありますでしょうか?

現細胞内βアクチンの量の変化ですが、あまり変化しないと思われますが刺激時間によっては変化が出る可能性もあるかと思われます。

伸展状態の細胞骨格の蛍光観察を行いたいと考えているのですが、HP上の蛍光染色の手順では膜の伸展が保たれず、弛緩してしまいます。
装置から取り外してすぐ細胞を固定した場合、細胞の状態は伸展膜上の細胞の状態とほぼ同じと考えて、問題はないのでしょうか?
また、膜を伸展させた状態で蛍光染色および観察は可能でしょうか?

そのようにお考え頂いて結構ですが、ご心配があるようでしたらチャンバーを装置から取り外す前に固定すればほぼ問題ないと思います。しかし、伸展させた状態で固定したいのであれば、20ページの手順で行うか、弊社取扱製品の伸展スタンド・トライアルキットをお使いいただくと操作が簡単に行えます。

チャンバーで細胞に伸展刺激を加え、染色固定して観察しようと考えているのですが、このチャンバーは染色固定で劣化したり、あるいは変色したりする心配はないのでしょうか?
現在予定している染色はAlizarin red染色で、メタノールで固定しAlizarin redでCa沈着を染色するというものです。細胞培養Q&Aの冊子を見ますと蛍光染色をした例はあるようですね。Alizarinでなくとも、一般にこのチャンバーでの固定染色で注意すべき点など、もしありましたらご教示をお願いいたします。

固定時にアセトン・クロロフォルムを使用すると若干シリコン膜が膨張する可能性があります。メタノールなどは問題ありません。
予めシリコンチャンバー膜を5mm×5mm程度に切り出しておけば操作は簡単です。観察時にはカバーグラス上に細胞面を向けて(下向き)に乗せるときれいに観察することが出来ます。

ストレッチチャンバー上で細胞のSEM固定を行おうとしているのですが、ブチルアルコールおよびヘキサメチルジシラザン(HMDS)を用いたところ、チャンバーが膨張してしまいました。
乾燥させるとどちらの場合も元の形状には戻りましたが、細胞をSEM観察したときには膨張の影響で細胞が剥離していました。
よって、膨張させることなくSEM固定させたいのですが、チャンバーに影響しない試薬等はご存じないでしょうか。

ほかに、アセトン・クロロフォルムも膨張します。メタノールをご使用ください。

伸展後に細胞を固定して蛍光染色して観察する時、問題なく油浸レンズが使用できるのでしょうか?何か観察時の制約があるのでしょうか?

使用できますが、対物レンズの直径により物理的に使用できるチャンバーに限定があります。

ストレッチチャンバー(「STB-CH-04」、チャンバー面積2.0×2.0×1.0cm)を購入しました。チャンバーの底面の厚さは200μmとなっています。この厚さですと蛍光顕微鏡での観察を行おうとした場合焦点が合うのはx40レンズが限界かと思います。実際の実験でも、x40のレンズでの観察も難しい状況です。
現在のチャンバーは、x60やx100のレンズでの観察を想定しておられないでしょうか。チャンバー上の細胞をx100のレンズで蛍光観察した実績や、それを可能とする方法をご存知でしたらご教示いただけないでしょうか。

油浸レンズを使用されていますでしょうか。現行のPDMS膜の特性上Oilに暴露されると膜自身が膨化してしまい観察が難しくなります。できれば水浸レンズをお勧めします。
蛍光観察は固定標本をお使いでしょうか?通常我々は、固定・染色後、膜をカミソリ刃で切り出し、ガラスカバーグラス上にup-side-downの状態で封入し、観察しております。この場合はもちろん油浸レンズでの観察は何ら問題ありません。
GFPなどのライブイメージングをするのであれば、100μm程度の膜厚をもつチャンバーを作成することも可能です。既にPublicationもあります。

チャンバーは抗体染色に対応できますでしょうか?また注意点があれば教えていただけますでしょうか。

勿論です。以下に、Tipsを記しておきます。
・染色するためにはメス刃にてチャンバーから5mm四方の小片として切出すと扱いやすい。
・染色後は、封入液を一滴たらしたスライドガラスの上に、細胞面が下になるように気泡が入らないように乗せ、更にもう一枚小さめのカバーグラスで覆いサンドイッチにすると観察しやすい。

ストレッチ用チャンバーに生体膜をはりつけて行えるか。(細胞の方向性を保ちたい)

可能です。通常は、細胞シートを伸展できる 細胞シートクランプで伸展します。又は、2重構造のトランスウエル伸展で内側のチャンバーシートを生体膜に交換することもできます。

STB-140を使用して細胞の伸展実験を行っていますが、伸展終了後に伸展させた状態で、通常の光学顕微鏡を使って観察・撮影を行いたい場合、どのような方法が考えられるでしょうか。貴社のHPに伸展後の顕微鏡観察写真を掲載しておられますが、どのように撮影されたのでしょうか。 また、顕微鏡で観察後、RNA抽出、Western Blotting等を行いたいと考えています。

STB-140を使用しての顕微鏡写真撮影は難しいので、金属棒が4本立った支持台を利用すれば伸展状態の細胞の撮影することが可能です。HPの伸展後の顕微鏡写真ですが、蛍光染色写真の方は1時間伸展刺激を加えた後、伸展装置から取り外して、つまりリラックスした状態で固定⇒染色した像です。
伸展中の写真をご希望であれば、上記方法で撮影するか、顕微鏡上伸展システムの使用をお勧めします。伸展刺激後にRNA抽出、Western Blottingは問題なく出来ます。しかし、チロシンリン酸化反応などを見たいのであれば、しかるべき脱リン酸化酵素阻害処理をしておかないと経時的に反応が減弱することがあります。

STB-140を使用しての顕微鏡写真撮影を考えています。金属棒が4本立った支持台の利用というのは、シリコンチャンバーをセットした4本の金属棒(本体のブラケットにシリコンチャンバー分立っているピン)と同位置に金属棒4本を設定できる支持台を設計し、伸展実験後にブラケットの金属棒から支持台の金属棒へチャンバーをスライドさせるということでしょうか。
また、伸展後にブラケット(上記のシリコンチャンバーセットのための金属棒が立った金属板)2枚の間の位置を何らかの方法で固定してブラケットを本体から取り外し、顕微鏡下に置くという方法についてはどうお考えでしょうか。この場合、本体とブラケットの装着、脱着を繰り返すことになりますが、問題点等ありますでしょうか。

いわゆるstatic stretch用のチャンバー把持台があります。ご希望の伸展度(例えば120%など)を指定いただければ用意できます。

慣れれば問題ないと思います。実際、私のところの大学院生は2枚のブラケット両サイドの間にアルミ片を渡し、クリップで固定して取り外しています。または、ブラケットごと本体から取り外してから開創器で所定の伸展度まで開いた後、アルミ片を渡してクリップで固定します。ただし、慣れないと少し難しいです。

細胞の接着について

チャンバーをオートクレーブしUVにあてながらコラーゲンコートしたのですが(1.5時間)細胞が接着しませんでした。なにか考えられる原因があったら教えてください。

UV当てながらのコーティングはタンパク質が変性してしまいます。37℃インキュベータに入れてコーティングしてください。またファイブロネクチンコートしてからUVをかけると、ファイブロネクチンが変性してしまいますのでご注意ください。

ストレッチチャンバーによって細胞がうまく接着したり、しなかったりするような気がします。何か原因がありますか?

ストレッチチャンバーに細胞を播種する際にチャンバーの底面に皺や気泡などがありませんか?ストレッチチャンバー底面は、皺などが無いように注意を払い製作していますが、極めて薄い為、微妙にしわがあるものもあります。
そこで、ストレッチチャンバーをディッシュ内に置くときに、まずディッシュ上にエタノールを少量垂らし、ストレッチチャンバーとディッシュの間に空気が入らないように傾けながら置き、しばらく放置してエタノールを蒸発させることにより最適な状態で細胞を撒くことができます。

希釈溶液を投入後、室温4時間静置するという方法が紹介されております。このコーティング溶液を投入する前に、シリコン膜の親水化処理を施す必要はないのでしょうか。

ストレッチチャンバーには出荷前にプラズマ処理にて親水化処理をしています。

静置時間が4時間以上と紹介されておりますが、4時間以上静置することでコートがされたということをどのように確かめたのでしょうか。

コーティング後のことだと思います。コラーゲンなどは風乾する人もいるようです。我々はファイブロネクチンを用事調整で使用しているので経験はありません。

表面のメチル基に対し、前処理などは行わずにフィブロネクチンなどでコーティング処理をされているのでしょうか?たとえば、強い紫外線をあてて、メチル基を変性させたりするなどはいかがでしょうか?

特にチャンバー表面処理は行っていません。プラズマ処理などのチャンバー表面処理は細胞との非特異的吸着を招きます。純粋に、ファイブロネクチン・コラーゲンとインテグリン類との結合を見るときには、プラズマ処理なしの疎水性が強い状態でないと実験結果の解釈にブレが出ます。紫外線などでもメチル基をOH基に変換することができますが、プラズマ処理・コロナ放電処理などと同じ結果です。

フィブロネクチンは今回試してみるつもりです。ゼラチンは以前試してみました。よい時と悪いときがありコラーゲンに替えていました。

我々の印象では、軟骨細胞の場合はコラーゲンよりゼラチンのほうが接着性が良好でした。

starvationについては、コントロールが上がりやすいので時間的に短くできるか検討してみます。刺激パターンについては、今回の実験で行っている速度は非常に遅く(1往復/分・歯根膜細胞)、10%の刺激自体も細胞障害性などが出ないレベルであることを確認してますので、この点は影響が少ないと考えております。むしろチャンバーを機械にのせる際に与える刺激などの方が大きくならないように注意しています。

starvationは非常にトリッキーです。あまりにやりすぎると見えるべき反応が見えなくなることがあります。一度、Starvationなしで試したらいかがでしょうか。

ストレッチチャンバーに細胞が接着していることを顕微鏡で確認後に伸展させました。伸展後細胞を確認すると、ストレッチチャンバーから剥がれていて伸展できていません。

一般的に細胞がオーバーコンフルエントになると細胞間接着力が細胞ー基質間接着力を上回り剥がれる傾向があるようです。細胞を多く撒きすぎると、細胞分裂後に隣接する細胞同士が接着してしまいます。これは通常ディッシュでも見られますが、ストレッチチャンバー上ではその傾向が顕著です。細胞の撒く量を減らしてリトライしてみて下さい。

また、酵素処理(特にトリプシン)などにより細胞にダメージがある場合ですが、通常ディッシュでは非特異的結合により一見接着しているように見えます。しかしストレッチチャンバー上ではコーティングした細胞外基質のみでの接着ですのでかなりシビアに処理をしないといけません。酵素処理時間・濃度・温度など最適化する必要があります。細胞にダメージがあり、コーティングが充分でない場合には、細胞を接着させることはできません。コーティング時間を長くしてみて下さい。また、弊社では確認できていませんが、複数の試薬を配合しコーティングしている研究者もいるようです。

ストレッチチャンバーに細胞を均一に撒きたいのですが、細胞が中央に集まってくるような 気がします。何か対策はありますか?

インキュベーター内の微弱な振動により、細胞がストレッチチャンバーの中央に集まることがあります。その場合には、細胞を撒いた15分後に、ストレッチチャンバーを軽く、ゆっくりと、左右に傾けながら揺すってみてください。

ストレッチチャンバーにコラーゲンコートを行う場合に、御社の例ではペプシン消化コラーゲンを用いていますが、特別な理由があるのでしょうか。酸で調整したものでは不都合があるのでしょうか?

プロトコールは例として記載しております。通常のコラーゲンをご使用いただいても問題ございません。

尿路上皮細胞で実験しております。論文を見ると、足を伸ばしたような細胞が伸展刺激時に刺激されているように見えます。我々はその日の内にimagingに持っていきますが、足を伸ばしたような細胞の数は少ないのですが伸展時に形態が変化し Ca濃度が上昇します。
ただほとんどの細胞は丸く、そういった細胞と比較し反応が明らかに鈍いようです。数的に足を伸ばした細胞を尿路上皮細胞と考えてよいのか疑問です。培養時間を長くすると足を伸ばした細胞が増えるのでしょうか? また、丸い細胞は接着しても伸展されにくい、というような事はありますでしょうか?

培養時間(接着時間)が2時間とのことですが、十分にチャンバーに接着していない場合も考えられますので、培養時間をもう少し長くして検討いただけますでしょうか。丸くなっている細胞ですが、一般論として丸い細胞は広がった細胞に比べて伸展されにくく、Ca上昇も低いです。尿路上皮細胞の同定法(免染など)で同定ください。

コラーゲンを希釈する希塩酸のことなのですが、固定観念なのかもしれませんが揮発性物質である塩酸を希釈度合いがかなり高いからといってもオートクレーブにかけることに少し抵抗があります。問題なければいいですがフィルターを通す方法でも代用できますか?

オートクレーブはせず、フィルターを通す方法でお願いいたします。

長期培養をしながら伸展刺激を負荷させたいのですが、どのくらいの期間まで可能ですか?

細胞にもよりますが、インキュベーター内で2週間は可能です。但し2~3日に1回程度、培養液の交換が必要です。その為の培養液自動管理装置もご用意することができます。また、長期培養時は、モータ冷却水の量が充分かどうかの確認も必要です。冷却水の量が不十分な場合には、モータ周辺部の温度が上昇し細胞が死滅してしまったり、装置が破損する場合があるので、注意が必要です。

心筋細胞の接着は伸展させると剥がれてしまい、苦慮しています。トリプシン濃度や時間もこれ以上減らすと細胞単離できないところまで下げましたが剥がれてしまいます。また何かヒントあれば、教えてください。

ランゲンドルフ灌流での急性単離標本でしょうか。またはいったん培養したものでしょうか。我々は、いったん培養したものを使用しています。

マウスの細胞を(NIH3、MEG)、フィブロネクチンコートした10cc、4ccチャンバーで50時間以上伸展培養するとはがれてしまって困っております。培養細胞の量は、100μ/mlです。文献ですと、Ikemoto、Bio FLEXインターナショナルNCなどのメーカーですと長時間の伸展培養も上手くいっているとの事です。

細胞の状態:

細胞の状態が接着性に大きな影響を与えます。特に細胞の取り扱いに細心の注意を払わなければなりません。トリプシンで細胞をディッシュから剥がす場合、濃度は極力低目できわめて短時間(数十秒)で処理し、細胞が変形し始めたのを顕微鏡で確認次第、壁などにシャーレを打付けて機械的に剥がします。トリプシン反応を停止させるために氷冷した培養液を即座に加えピペッティングにより細胞を分散させます。ここまでの手技が確実に出来るのであればストレッチチャンバーに播いてから10~30分の間に細胞はきれいに伸展接着します。

細胞の種類

お問い合わせのうち、NIH3T3,C2C12は使用経験があり50時間ではがれることはなかったと思います。NIH3T3の論文をご案内します。この論文では実際に50時間以上培養した実験結果を載せておりませんが問題ありませんでした。また、C2C12細胞に関しては下記のとおり培養しており、これも剥がれることなく培養できています。

細胞密度

細胞種にもよりますが、細胞間結合力が細胞ー細胞外基質間接着力を上回るとシート状になって剥がれてきます。通常コンフルエント状態では問題ありませんが、オーバーコンフルエント状態で長らく培養した場合、シート状になって剥がれる場合があります。

フィブロネクチン:

チャンバーへの細胞の接着は、100μg/mlのフィブロネクチン(SIGMA F1141 Fibronectin 0.1% solution,From Bovine plasma)とのことですが、この濃度であれば問題ありません。ただし我々は自家調整したヒトフィブロネクチンを使用しています。フィブロネクチンの処理条件は如何でしょうか?通常は37度、30分で良好な結果を得ています。
接着性が悪い場合は時間を数時間に伸ばすことで対応できます。フィブロネクチン処理後、フィブロネクチン液を吸引したときストレッチチャンバー表面は一面ぬれた感じになっていますか?直ぐはじくようであれば、コーティングされていないことが考えられます。新しいチャンバーはプラズマ処理により膜表面に非特異的チャージ処理をしてありますので接着性は向上しているはずです。しかし、細胞外基質による結合だけではありません。

C2C12細胞条件-抜粋

Dr. Takashi Obinata (Department of Biology, Chiba University,Chiba, Japan) kindly supplied us with a subclone of the mousemyogenic (myoblastic) cell line (53), C2C12.
Cells were maintained as undifferentiated myoblasts in high glucose (4.5 g/ l) DMEM containing 15% FBS (vol/vol) in a tissue culture incubator at 37℃ in a humidified atmosphere of 5% CO2 and 95% air.
The cells were passaged when they reached the state of about 70% confluency, and the medium was changed three times a week. For the experiments, C2C12 myoblasts were removed from the culture dish with 0.01% EDTA-0.25% trypsin and transferred to a 10 cm2 elastic silicone chamber (used for the 2-deoxy-D-glucose uptake assay), or to a 1 cm2 elastic silicone chamber (used for Ca2+ measurements) at a density of 2.0×104 cells/cm2.
All chambers had a 200  m thick transparent bottom on which the cells were cultured. The bottom had been precoated with 0.05% porcine type I collagen (Koken, Tokyo, Japan).
After 2 days of incubation, the myoblasts were found to be confluent. At this point, to induce the differentiation of myoblasts into myotubes, the culture medium was replaced with low glucose (1.0 g/l) DMEM containing 5% HS (vol/vol), which was changed every other day.
Fully differentiated myotubes were attained 7 days after seeding the cells. 2-day-old myoblast cells and 7-day-old myotube cells were used for the following experiments.

(参考論文:Calcium regulates the PI3K-Akt Pathway in stretched osteoblasts)

チャンバーに接着させ、その後ストレッチを伸展率10%、サイクル数6回/分で行ったところ、およそ24時間でC2C12細胞が剥がれてしまいました。
以前にコラーゲンタイプⅠ(3.13mg/ml)を0.02Nの酢酸で50μg/μlに希釈してコーティングを行いました。しかし、細胞が接着しませんでした。【C2C12細胞条件-抜粋】に記載してある0.05%コラーゲンとはどのくらいの濃度でしょうか?

以前お示しした方法で細胞を剥がしていますでしょうか?この実験系では細胞の取扱いが非常に重要になってきます。この段階でC2C12細胞を分化させていませか?他の研究室でも確認しましたが、同じ細胞を用いて問題なく接着し実験できています。
50-100μg/mlであれば問題なく接着します。コラーゲン処理の場合、PBSなどで洗浄しましたよね?pHが問題になるときがあります。ゼラチンの方が使用しやすい場合があります。

細胞に伸展刺激をしてサイトカインの発現等を見ようと考えているのですが、ストレッチシステムで3T3L1細胞の伸展を試されたことがあるでしょうか?また3T3L1細胞から分化した脂肪細胞はどうでしょうか?脂肪細胞だとおそらく浮いてきてしまうので難しいとは思いますが...

3T3L1細胞伸展刺激の経験はありませんが、共同研究者が以前伸展刺激を与えていましたので問題ないと思います。伸展可能シリコンゴム上での培養システムですので、接着細胞であれば伸展刺激を与えることが出来ます。もしくは三次元培養用チャンバーを使用して、ゲル内での培養も可能です。

10%TYPE-Iコラーゲン(新田ゼラチン)塩酸水溶液3MLでコーティングしたチャンバーをDMEMで2回洗浄した後に0.25%トリプシンで剥がしたC2C12細胞を播種していますが、接着にムラが大きくストレッチをかけれないこともしばしばあります。上手く接着、増殖させるにはどのようにすればよいのでしょうか?

メーカー:㈱高研(KOKEN)
製品名 : IAC-50 AteloCellR Native collagen Bovine Dermis 5mg/mL

*コーティング方法

①上記コラーゲンを滅菌水で25倍希釈する。

②37℃ CO2インキュベータで30分以上でコーティング。(O/Nも可)

 ※通常は、30分程度が多いのですが、今回はO/Nでコラーゲンコートしました。30分のコーティングでも通常全く問題ありません。

③コラーゲン液を吸い取る。

④滅菌水で2回洗浄する。

 ※すぐに使用しない場合は、クリーンベンチ内でしっかり風乾し、30分程度UVを当ててから保管しています。

①播き数は10万/チャンバー(培地3ml)でしょうか。

 播き数は今回のストレッチ実験に関しては細胞カウントしておりませんが、経験上、20万個/チャンバー(培地4ml)だと思われます。

②コラーゲンの希釈に滅菌水を用いるとありますが、pH3の塩酸水溶液ではないですか。

メーカーの推奨プロトコールは、塩酸でph3に調整した蒸留水で希釈しているようです。
メーカーのプロトコールのURLを添付しますので、一度ご確認ください。
 http://www.atelocell.com/pdf/I_PC-AC.pdf
 ※ 当研究室では、滅菌水(ph調整無し)を使用しております。

③CO2インキュベータ内でコーティングとありますが、室温よりもよろしいのでしょうか。

通常室温でのコーティングを推奨しているようですので、室温で問題ないと思います。
②③に関しましては、メーカーの担当者に一度確認していただくことをお勧めします。こちらでは、コラーゲンコートに関しましては②③の方法を取っておりますが、今までのところ特に問題はありません。

④コーティングに用いている25倍希釈のコラーゲン液の量は何mlでしょうか。

特に決めておりません。今回は3~4ml程度使用しましたが、チャンバー底面が覆われる量であれば、問題ないかと思います。

神経細胞での実験を検討しておりますが、コーティングはラミニンでも問題ないでしょうか。

弊社でのラミニンコートの実績はございませんが、コーティングに関して問題はないと思います。

チャンバーに細胞を播くときはどのぐらいの密度がよいのでしょうか?

以前お示しした方法で細胞を剥がしていますでしょうか?この実験系では細胞の取扱いが非常

実験内容によって変わりますが、目安として5×10^4/平方センチメートルぐらいです。

チャンバーをオートクレーブするとき滅菌専用バッグを使うようにとなっておりますが、アルミホイルで蓋にしたガラスのビーカーでも宜しいでしょう か?

基本的にストレッチチャンバーはディスポーザブルとなっております。上記内容でのオートクレーブも可能ですが、再利用されると表面が改質し、実験結果が再現できない可能性がありますことご了承願います。

使用細胞に関する質問

GFP融合蛋白(actinなど)を発現させた細胞を40-60倍レンズでtime-lapse撮影したmovieがあればfileを送っていただくか、文献を紹介していただけますか?

下記の論文に、GFP-actin導入細胞をストレッチチャンバー上で伸展した時の蛍光像写真があります。残念ながらMovieはとってありません。

Wang NNaruse KStamenović DFredberg JJMijailovich SMTolić-Nørrelykke IMPolte TMannix RIngber DE.

Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):7765-70.

血管平滑筋細胞なのですが一般的には60回往復/分、伸展率は10%と前回教えて頂いたのですが論文とかをひいてみると0^20%の伸展率で様々ですが病的モデルの場合、例えば高血圧の時の血管平滑筋細胞を再現したい時は伸展率は何%になるのでしょう?
また、一般的にと言われ10%の伸展率は平滑筋細胞が生体内で受ける正常なストレッチと理解して宜しいでしょうか?

高血圧の時に何が起こるかは見たい場所によって異なり、一概に決まった伸展パターンを推奨することは非常に難しいのですが、最初の取りかかりとして60回/分、伸展率15~20%で検討いただければいかがかと思います。生体内での平滑筋の負荷は10%程度となります。

心筋細胞を伸展させたいのですが?

文献(Orientation Change of Cardiocytes Induced by Cyclic Stretch Stimulation:Time Dependency and Involvement of Protein Kinases)を参考にしてください。

患者由来の単球細胞またはTHP-1細胞などの単球系Cell lineにshear stressを負荷したいのですが?

弊社製品はシリコン系エラストマー(PDMS)の上に細胞を培養し、エラストマーを伸展することにより細胞を伸展します。従って、接着可能な細胞を前提としたシステム構成になっており、いわゆる血液からのshear stressをこのシステムで負荷することは困難です。Shear stressに関してはmicrofluidicsを利用したシステムがありますが、これも付着細胞を使用しないと定量的なshear stressを与えることが出来ません。

遺伝子導入した細胞をストレッチしたいのですが?

ストレッチチャンバー上で直接遺伝子導入することもできます。しかし、導入操作自身で細胞がダメージを受けますのできれいな画像をとることが難しいので一度ディッシュ上で導入を行った後、ストレッチチャンバー上に播きなおした方がベターだと思います。

血管内皮細胞を使った文献(Naruse et al, Am J phsiol,1998)を参考に伸展率20%、周期1Hzにて2時間、C2C12と平滑筋細胞に伸展刺激を行いました。
フィブロネクチンコートで両細胞とも良好な接着が見られました。伸展刺激の結果ですがC2C12はコントロールと比較しても、垂直方向に整列する現象は全く見られませんでした。
平滑筋細胞は位相差で見た際には、一部整列しているように見える領域はありました。 ただ顕著な変化は捉えられませんでした。細胞種によって整列化現象の起き易さにも違いはあるのでしょうか?
試験条件等で検討した方が良い点ありましたらお教え下さい。

細胞種による伸展依存性形態変化のおきる条件は異なります。また、プラスティック培養シャーレからストレッチチャンバーへ播種するときの細胞処理条件(酵素処理時間・温度etc)、細胞濃度、ストレッチ開始の時期などによっても変わります。また、C2C12、平滑筋細胞などはもともとの形態が紡錘形をしているのでストレッチをしなくても、一部整列しているような形態が見られますので注意を要します。

各種プロトコール

ストレッチ後の蛍光染色の手順について

ストレッチ後の細胞を染色固定する場合には、下記の手順を参考にしてください。

  1. ストレッチチャンバーから細胞面をメスで切り出してください。(0.8×0.5cmくらいの大きさ)→2.以降で用いる容器の大きさによって異なります。ストレッチ方向に長くなるように切り出すとあとからストレッチ方向が判りやすいです。
  2. PBS(‐)が入った容器に1.の膜を入れてください。
    1×1チャンバー(枠なし)をカバーガラスに貼り付けたものを使用。
  3. PBS(‐)wash、2times 
  4. 4%ホルマリン in PBS(‐)で固定→RT、5min<振とう処理>
  5. PBS(‐)wash、RT、5min、3times 
  6. 0.1% TritonX-100 in PBS(‐)で細胞膜に穴を開ける→RT、5min<振とう処理>
  7. PBS(‐)wash→RT、5min、3times 
  8. 2% BSA in PBS(‐)でブロッキング→RT、30min<振とう処理>
  9. 1次抗体 in 0.1%Tween20 in PBS(‐)→RT、30min<振とう処理>
  10. 0.1%Tween20 in PBS(‐)wash→RT、5min、3times   
  11. 2次抗体 in 0.1%Tween20 in PBS(‐)→RT、30min<振とう処理> 
  12. 0.1%Tween20 in PBS(‐)wash→RT、5min、3times 
  13. スライドガラスの上に乗せ封入( Perma Fluor)→細胞面を下にして下さい
  14. 蛍光観察

伸展させた状態での蛍光観察(熟練の技術を要します)

チャンバーのコーティング:フィブロネクチン

ストレッチチャンバーの耐熱温度は0~180℃です。それ以外の温度での取り扱いは保証できませんので、ご注意ください。コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。

  1. ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20 min)してください。
  2. フィブロネクチンを、PBSにて0.05mg/mlになるように希釈して下さい。
  3. 培養皿内のチャンバーにフィブロネクチン希釈溶液をストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いでください。
  4. その状態のまま、37℃で4時間以上インキュベートしてください。
    ※ご使用される試薬の条件でインキュベートしてください。
  5. 培養皿をインキュベーターから取り出し、ストレッチチャンバー内の希釈溶液をピペットなどで取り出してください。
  6. 滅菌水にて2回洗浄してください。

■和光純薬 Fibronectin,牛血漿製  
型番:300-13401 1mg入り
M.W:220kDaの二量体
純度:SDS-PAGE(還元条件下)にて220kDa付近に2本のメインバンドを認める。
   アフィニティークロマトグラフィー精製
形状:タンパク濃度1mg/ml(0.1M NaCl、0.05M Tris-HCl)
バッファーで、0.22μm濾過滅菌済みの凍結乾燥品

■ミリポア HUMAN PLASMA FIBRONECTIN PURIFIED PROTEIN
型番:FC010

チャンバーのコーティング:コラーゲン

ストレッチチャンバーの耐熱温度は0~180℃です。それ以外の温度での取り扱いは保証できませんので、ご注意ください。コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。また、コラーゲンはペプシン消化コラーゲンではなく通常のコラーゲンを調整してご使用いただいても問題ございません。

  1. ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20min)してください。
  2. コラーゲンをオートクレーブした希塩酸(pH3.0,10-3M)で10倍希釈した希釈溶液にしてください。
  3. ストレッチチャンバーを培養皿内に置き、ストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いでください(目安として2~3mmの高さ程度)。
  4. そのままクリーンベンチ内に置いて、室温で4時間以上静置させてください。
  5. 静置後、乾燥している方が良いですが、溶液が残っている場合は、ピペットなどでコラーゲン溶液を吸い取ってください。
  6. Serum-freeの培養液で、余分なコラーゲン溶液を取り除く為に2~3回洗浄して下さい。
  7. 細胞懸濁液を加えて、培養を開始してください。

■高研(KOKEN)
IAC-50 AteloCellR Native collagen Bovine Dermis 5mg/mL・Cellmatrix TYPEⅠ-C(ブタ腱由来ペプシン可溶化)20mL 
保存:4℃

■新田ゼラチン株式会社等
希塩酸(pH3.0,10-3 M)調整後、 オートクレーブ

その他のコーティング方法例

  1. ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20min)してください。
  2. KOKEN IPC-50(5mg/ml)を滅菌水で20倍希釈し、チャンバーに3mlずつ入れる。
  3. インキュベーター内で一晩放置します。
  4. 翌朝、コラーゲン水溶液を取り除き、滅菌水でチャンバーを数回洗浄します。
  5. 滅菌水を全て吸い取り、安全キャビネット(クリーンベンチ)内でUVなしで6時間乾固します。

チャンバーのコーティング:ゼラチン

ストレッチチャンバーの耐熱温度は0~180℃です。それ以外の温度での取り扱いは保証できませんので、ご注意ください。コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。

  1. ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20min)してください。
  2. PBSに対し、2%のゼラチンパウダーを加えた溶液を用意してください。
  3. その溶液をオートクレーブ処理してください。
  4. 培養皿内のストレッチチャンバーにその溶液を、ストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いでください。
  5. その状態のまま、37℃で4時間以上インキュベートしてください。
  6. 培養皿をインキュベーターから取り出し、ストレッチチャンバー内の希釈溶液をピペットなどで取り出してください。

チャンバーのコーティング:PDL(ポリリジン)

ストレッチチャンバーの耐熱温度は0~180℃です。それ以外の温度での取り扱いは保証できませんので、ご注意ください。コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。

  1. PDLを血清無添加DMEM培地で4000倍希釈してください。
  2. クリーンブース内に設置したプラズマクリーナーにて、チャンバーを10秒間プラズマ処理し、ただちにPDL希釈液を4ccチャンバーに1.5mL注いでください。10ccチャンバーの場合は3.0mL注いでください。
  3. 滅菌シャーレに入れ、蓋をして、インキュベーター内に1~4時間静置してください。
  4. インキュベーターから取り出し、チャンバー内の余分なPDF希釈液をピペットで吸引してください。
  5. 無血清培養液あるいはPBSで、2回程度すすぎ余分なPDLを取り除きます。
  6. 細胞を播種してください。

Poly-D-Lysine Hydrobromide,High Molecular Weight(BD #354210推奨)

ストレッチチャンバーの洗浄方法

基本的にストレッチチャンバーはディスポーサブルとなります。また、洗浄しても膜面の汚れが完全に取れるということではございません。再利用されると表面が改質し、実験結果が再現できない可能性がありますことご了承ください。

  1. 実験に用いた後、ストレッチチャンバー全体を中性洗剤に1時間以上浸漬させてください。
  2. 中性洗剤を使い、超音波洗浄器にて10分間洗浄をしてください。
  3. 綿棒や柔らかいスポンジ等で、チャンバーの細胞の接着面を軽くこすってください。
  4. 中性洗剤を使い、超音波洗浄器にて10分間洗浄をしてください。
  5. 水道水などの流水で充分に中性洗剤を洗い流し、その後、精製水で洗浄してください。
  6. 顕微鏡で細胞などの残骸が無いことを確認してください。
  7. オートクレーブ処理をしてください(121℃ 20min)。
  8. 細胞外基質でストレッチチャンバーをコーティングしてください。

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