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詳しい手順・機器の操作方法に関するQ&A集

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ストレッチ後の蛍光染色の手順について

ストレックスからの回答:

ストレッチ後の細胞を染色固定する場合には、下記の手順を参考にして下さい。

  1. ストレッチチャンバーから細胞面をメスで切り出してください。
    (0.8×0.5cmくらいの大きさ)→2.以降で用いる容器の大きさによって異なります。
    ストレッチ方向に長くなるように切り出すとあとからストレッチ方向が解りやすいです。
  2. PBS(‐)が入った容器に1.の膜を入れて下さい。
    (1×1チャンバー(枠なし)をカバーガラスに貼り付けたものを使用) 
  3. PBS(‐)wash、2times 
  4. 4%ホルマリン in PBS(‐)で固定→RT、5min、振とうさせて下さい
  5. PBS(‐)wash、RT、5min、3times 
  6. 0.1% TritonX-100 in PBS(‐)で細胞膜に穴を開ける→RT、5min、振とうさせて下さい
  7. PBS(‐)wash→RT、5min、3times 
  8. 2% BSA in PBS(‐)でブロッキング→RT、30min、振とうさせて下さい
  9. 1次抗体 in 0.1%Tween20 in PBS(‐)→RT、30min、振とうさせて下さい
  10. 0.1%Tween20 in PBS(‐)wash→RT、5min、3times   
  11. 2次抗体 in 0.1%Tween20 in PBS(‐)→RT、30min、振とうさせて下さい 
  12. 0.1%Tween20 in PBS(‐)wash→RT、5min、3times 
  13. スライドガラスの上に乗せ封入( Perma Fluor)→細胞面を下にして下さい
  14. 蛍光観察

伸展させた状態での蛍光観察 (*こちらの作業は熟練の技術を要します) 

スクリーンショット 2014-03-27 10.24.45


ストレッチチャンバーの各種コーティング方法について 

ストレックスからの回答:

ストレッチチャンバーの耐熱温度は、0~180℃です。それ以外の温度での取り扱いは保障

できませんので、ご注意下さい。

 

≪1:フィブロネクチンでのコーティング方法≫

*コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。

1-1:ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20分)してください。

1-2:フィブロネクチンを、PBSにて0.05mg/mlになるように希釈して下さい。

1-3:培養皿内のチャンバーにフィブロネクチン希釈溶液をストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いでください。

1-4:その状態のまま、37℃で4時間以上インキュベートしてください。

    ※ご使用される試薬の条件でインキュベートしてください。

1-5:培養皿をインキュベーターから取り出し、ストレッチチャンバー内の希釈溶液をピペットなどで取り出してください。

1-6:滅菌水にて2回洗浄してください。

 

試薬(市販品)(例):フィブロネクチン

■和光純薬 Fibronectin,牛血漿製  品番 300-13401 1mg入り
M.W : 220kDaの二量体
純度:SDS-PAGE(還元条件下)にて220kDa付近に2本のメインバンドを認める。
   アフィニティークロマトグラフィー精製
   形状:タンパク濃度1mg/ml ( 0.1M NaCl 、0.05M Tris-HCl )
   バッファーで、0.22μm濾過滅菌済みの凍結乾燥品

■ミリポア HUMAN PLASMA FIBRONECTIN PURIFIED PROTEIN  品番 FC010

 

≪2:コラーゲンでのコーティング方法≫

*コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。また、コラーゲンはペプシン消化コラーゲンではなく通常のコラーゲンを調整してご使用いただいても問題ございません。

2-1:ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20分)してください。

2-2:コラーゲンをオートクレーブした希塩酸(pH3.0,10-3M)で10倍希釈した希釈溶液にしてください。

2-3:ストレッチチャンバーを培養皿内に置き、ストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いでください。(目安として2~3mmの高さ程度)

2-4:そのままクリーンベンチ内に置いて、室温で4時間以上静置させてください。

2-5:静置後、乾燥している方が良いが溶液が残っている場合は、ピペットなどでコラーゲン溶液を吸い取ってください。

2-6:Serum-freeの培養液で、余分なコラーゲン溶液を取り除く為に2~3回洗浄して下さい。

2-7:細胞懸濁液を加えて、培養を開始する。

 

試薬(例): ・㈱高研(KOKEN)
IAC-50 AteloCellR Native collagen Bovine Dermis 5mg/mL

・Cellmatrix TYPEⅠ-C (ブタ腱由来ペプシン可溶化)、20mL 保存;4℃

(新田ゼラチン株式会社等)

・希塩酸(pH3.0,10-3 M)調整後、 オートクレーブ

 

■そのほかのコーティング方法(例) 

2-8:ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20分)してください。

2−9:KOKEN IPC-50(5mg/ml)を滅菌水で20倍希釈、チャンバーに3mlずついれる。

2−10:インキュベーター内で一晩放置

2−11:翌朝、コラーゲン水溶液を取り除き、滅菌水でチャンバーを数回洗浄

2−12:滅菌水を全て吸い取り、安全キャビネット(クリーンベンチ)内で乾固(UVなし6h)

 

≪3:ゼラチンでのコーティング方法≫

*コーティング剤に関しましてはご参考までに記載しております。標記製品でないと使用できないということではありません。

3−1:ストレッチチャンバーをオートクレーブ処理(121℃ 20分)してください。

3−2:PBSに対し、2%のゼラチンパウダーを加えた溶液を用意して下さい。

3−3:その溶液をオートクレーブ処理して下さい。

3−4:培養皿内のストレッチチャンバーにその溶液を、ストレッチチャンバーの底面が覆われるように注いで下さい。

3−5:その状態のまま、37℃で4時間以上インキュベートしてください。

3−6:培養皿をインキュベーターから取り出し、ストレッチチャンバー内の希釈溶液をピペットなどで取り出して下さい。


ストレッチチャンバーの洗浄方法

ストレックスからの回答:

*基本的にストレッチチャンバーはディスポーサブルとなります。

また、洗浄しても膜面の汚れが完全に取れるということではございません。

再利用されると表面が改質し、実験結果が再現できない可能性がありますことご了承願います。

1:実験に用いた後、ストレッチチャンバー全体を中性洗剤に1時間以上浸漬させてください

2:中性洗剤中で10分間ソニケート処理(超音波洗浄)を行ってください。

3:綿棒または柔らかいスポンジ等で細胞の接着面を軽くこすってください。

4:中性洗剤中で10分間ソニケート処理(超音波洗浄)を行ってください。

5:水道水などの流水で充分に中性洗剤を洗い流し、その後、精製水で洗浄してください。

6:顕微鏡で細胞などの残骸が無いことを確認してください。

7:オートクレーブ処理をしてください。

8:前述の手順の通り、細胞外基質でストレッチチャンバーをコーティングしてください。